Молекулярно-генетичні механізми стійкості до холодового стресу в геномно-заміщеної форми пшениці: дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Loading...
Date
2017
Authors
Єфіменко, Тетяна
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
В дисертаційному дослідженні показано зв’язок архітектури кореневої системи геномно-заміщеного амфідиплоїда Авротіка з його підвищеною стійкістю до низьких температур. Амфідиплоїд Авротіка містить у своєму геномі тетракомпонент (ААВВ) геному сорту пшениці Аврора (ААВВDD) і ТТ геном диплоїдного виду Aegilops mutica (Boissier). Було створено інтрогресивні лінії, що походять від схрещування Авротіка х Аврора та наступного самозапилення. Під час створення інтрогресивних ліній, перевіряли кількість хромосом в первинних корінцях паростків (аналіз метафазних пластинок) для поколінь F3, F4 та F5, та добирали рослини з такою кількістю хромосом, від яких потім можна було отримати 42-хромосомні інтрогресивні лінії.
Наявність генетичного матеріалу Т геному Aegilops mutica в геномах інтрогресивних ліній було підтверджено методом дот-блот гібридизації з використанням геномної ДНК Ae. mutica як зонда; для більшості ліній було отримано позитивний сигнал. Оцінка рослин інтрогресивних ліній за деякими ознаками морфології колоса (остистість, форма та щільність колоса, колір зрілого колоса, опушення колосової луски, форма луски тощо) та вегетативної частини рослини (опушення зеленої рослини, воскова осуга), а також за ознакою стійкості до борошнистої роси також вказує на наявність чужинного генетичного матеріалу в їхніх геномах – більшість ліній відрізняються від сорту Аврора за декількома ознаками морфології та мають стійкість до борошнистої роси, яка, за нашими припущеннями, пов’язана з генами стійкості з Т геному.
Для встановлення наявності інтрогресій у складі хромосом 5 гомеологічної групи, де за даними літератури локалізовані основні гени, що відповідають за морозостійкість пшениці, було використано мікросателітний аналіз за тими SSR локусами, які вважаються специфічними до хромосом цієї групи. Спочатку було встановлено, праймери до яких мікросателітних локусів утворюють поліморфні продукти для Аврори та Авротіки, і далі за цими SSR локусами було проаналізовано рослини поколінь F4 та F5 (з використанням більшої кількості мікросателітних локусів). Продукти ампліфікації розділяли у поліакриламідному гелі за денатуруючих умов. З ДНК деяких ліній утворювався продукт ампліфікації, що не відрізнявся за електрофоретичною рухливістю від такого, що утворювався з ДНК Аврори. З ДНК інших ліній утворювався продукт ампліфікації, що не відрізнявся від продукту Авротіки, а з ДНК третьої групи ліній утворювався продукт, що був відмінним від продуктів обох батьківських форм (як Аврори, так і Авротіки). Утворення таких продуктів ампліфікації, не властивих жодному з генотипів ініціального схрещування Авротіка х Аврора, може пояснюватися утворенням нових алелів через підвищений рівень мутацій в ділянках SSR локусів. За наявністю алелів мікросателітних локусів, характерних для Авротіки, можна було припустити заміщення цілих хромосом 5-ої групи Аврори на хромосому 5Т Авротіки, або плечей цих хромосом, або формування "мозаїчних" хромосом, в яких чергуються ділянки хроматину Аврори та Авротіки. Утворення таких хромосом можливе через часткову рекомбінацію хромосом Т і D геномів. Для порівняння зимостійкості Аврори та Авротіки спочатку використовували непрямі методи: визначення вмісту вільного проліна, визначення електричної провідності (витікання електролітів), проте, за нашими результатами, характеристики Аврори за цими методами були кращими, ніж Авротіки – Аврора накопичувала більшу кількість вільного проліна від час періоду холодового загартовування, ніж Авротіка, а також Аврора мала менші показники електричної провідності, ніж Авротіка (витікала менша кількість електролітів після заморожування, що може вказувати на менший ступінь пошкоджень мембрани). Було зроблено висновок, що в основі кращої зимостійкості Авротіки, порівняно з Авророю, лежать інші механізми, відмінні від накопичення вільного проліна та меншого витікання електролітів.
Під час підготовки паростків Аврори та Авротіки до експерименту з лабораторного заморожування (в спеціальному рідинному термостаті з поступовим зниженням температури) було помічено, що при вирощуванні за низьких позитивних температур (4°С), Авротіка формує міцнішу, краще розвинену кореневу систему у порівнянні з такою Аврори. Це спостереження доло змогу припустити, що особливості кореневої системи Авротіки можуть мати зв’язок з її кращою зимостійкістю, і це було перевірено на наступному етапі дослідження. Щодо експерименту з лабораторного заморожування, то за його результатами Авротіка показала краще відростання, ніж Аврора.
Для вивчення розвитку кореневої системи були обрані інтрогресивні лінії, вивчені за структурою геному щодо хромосом 5-ої гомеологічної групи, оскільки показано участь хромосом цієї гомеологічної групи у формуванні ознаки морозостійкість. Розвиток кореневої системи вивчали на рослинах, вирощених у пакетах з ґрунтовою сумішшю, та рослинах, вирощених у польових умовах. Вимірювали такі характеристики кореневої системи: кількість коренів, максимальна довжина кореня, об’єм кореневої системи (визначали за об’ємом рідини, яку витісняє коренева система при зануренні у посудину з рідиною).
При порівнянні характеристик кореневої системи Аврори та Авротіки не було виявлено різниці за ознаками довжина найдовшого кореня та кількість коренів, але спостерігалася різниця за ознакою об'єм витісненої рідини. Було припущено, що Авротіка утворює більшу кількість бічних розгалужень коренів, або корені мають більшу товщину. За отриманими результатами, формування більш розвиненої кореневої системи, що оцінювалося за обсягом витісненої рідини, статистично значуще пов’язано з наявністю маркерів (алелів SSR-локусів) хромосоми 5Т замість маркерів хромосоми 5А. Це може вказувати на можливий зв’язок з хромосомою 5А пшениці генів, які беруть участь у формуванні кореневої системи пшениці.
Рослини, що вирощували в полі, оцінювали також за кущистістю (кількість продуктивних стебел) та успішністю зимування (кількість рослин, які після зими перейшли до стадії колосіння). Було показано, що Аврора відрізняється від Авротіки за співвідношенням об’єм коренів (за витісненою рідиною)/кущистість у менший бік удвічі. Лінії, які характеризуються високим відношенням об'єм коренів/кущистість, всі, крім однієї, показали більш високий відсоток рослин, що вижили, порівняно з показником Аврори. Отримані результати дали змогу припустити, що стійкість рослин ліній до зимових стресових умов пов’язана з об'ємом кореневої системи відносно продуктивної кущистості та збільшується разом зі зменшенням відношення кількісті продуктивних стебел до об'єму кореневої системи. Для пошуку генів-кандидатів, що можуть впливати на формування кореневої системи, аналізували продукти ампліфікації, що утворюють ДНК Аврори та Авротіки з праймерами до таких генів: AGL21 та AGL14 (гени MADS box транскрипційних факторів, що впливають на накопичення ауксина в корені), BRI – ген рецептора брасиностероїдів (фітогормони, які задіяні у регуляції розвитку коренів). Було перевірено також CBF-A14 – ген транскрипційного фактора родини CBF (C-repeat Binding Factor) – один з основних транскрипційних регуляторів морозостійкості. Між ДНК Аврори та Авротіки не було виявлено поліморфізму за спектрами продуктів ампліфікації з праймерами до генів ТаAGL14, BRI та CBF-A14, тому інтрогресивні лінії не аналізувалися з цими праймерами.
AGL21 кодує MADS box транскрипційний фактор, який позитивно регулює накопичення ауксину в примордіях бічних коренів через регуляцію біосинтезу ауксину, який стимулює ініціація і ріст бічних коренів. Показано наявність поліморфізму для продуктів ампліфікації, утворених з праймерами до другої частини гена TaAGL21. Ці праймери були використані для утворення продуктів ампліфікації з ДНК ліній – похідних Авротіки та аналізу продуктів ампліфікації щодо того, чи вони є схожі за масою на продукт Авротіки, чи на продукт Аврори. При порівнянні результатів з оцінкою зимостійкості показано, що лінії з алелем гена ТаAGL21, властивим Авротіці, за успішністю у перенесенні зимових стресів перевищують лінії, яким властивий алель Аврори за цим геном. Рослини для вимірювання характеристик кореневої системи вирощували в поліетиленових пакетах з ґрунтовою сумішшю в 2015 році за умов природного загартовування (поступове зниження температури восени), та в 2016 році в кімнаті контрольованого клімату за оптимальної температури (20°С) без холодового загартовування щоб встановити чи залежить розвиток кореневої системи від наявності/відсутності загартовування рослин і чи пов’язаний цей процес з алелем гена TaAGL21, властивим лініям. За отриманими результатами можна припустити, що природне загартовування сприяє формуванню більш розвиненої кореневої системи через збільшення довжини коренів за наявністю алеля "2" гена AGL21, в той час як без загартовування краще розвивається коренева система у рослин з алелем "1" гена AGL21. За кількістю коренів рослини, вирощені у 2016 році, не відрізнялись від таких, вирощених у 2015 році, можливо, що вираз цієї ознаки не залежить від загартовування. Для ознаки об’єм кореневої системи (визначений за об’ємом витісненої рідини) варіювання навколо групового середнього значення генотипних середніх в різні роки є однаковим для зразків з алелем "1" гена AGL21 та різним для зразків з алелем "2". В 2015 році (за умов загартовування) більш розвинену коренева система (більший об’єм витісненої рідини) мала Авротіка, а в 2016 році (без загартовування) Аврора утворювала більшу кореневу систему порівняно з Авротікою. Отже, за умов низьких температур, Авротіка формує краще розвинену кореневу систему, що може бути пов’язано з алелем "2" гена ALG1, що, в свою чергу, має позитивний зв’язок із зимостійкістю.
The dissertation is devoted to the investigation of mechanisms of higher winter hardiness of the amphidiploid Aurotica, which combines in its genome AABB tetracomponent of common wheat cultivar Aurora and TT genome of the diploid wild wheat relative Aegilops mutica (Amblyopyrum muticum). Introgressive lines Triticum aestivum / Aegilops mutica were developed by crossing Aurotica x Aurora and the following self-pollination of the hybrids, which was possible due to the recombination between the chromosomes of D and T genomes. Chromosome numbers were determined in hybrid generations F3, F4 and F5, and only 40-43-chromosome F4 plants were chosen to form F5 generation in order to get 42-chromosome euploids introgressive lines. Changes in chromosome plates of the hybrid plants were observed: presence of telocentric chromosomes, dicentric chromosomes and number of satellite chromosomes differing from Aurora and Aurotica. These changes could be evidence of chromosome rearrangements in the genomes of hybrid plants possibly caused by introgression of alien genetic material. Presence of T genome genetic material in the genomes of the introgressive lines was confirmed by dot blot hybridization with genome DNA of Aegilops mutica as probe; most lines demonstrated positive hybridization signals. Additionally, morphological traits assessment also gave evidence on the presence of alien genetic material (from T genome) in the genomes of the lines: all lines differed from Aurora at least for some traits that have been assessed (traits of the spike – like glume color, glume hairiness and others; and vegetative part of the plant – hairiness, glaucousness). Most introgressive lines also were resistant to powdery mildew, which should be due to resistance genes from T genome, as we assumed. In order to indentify introgressions in chromosomes of homeological group 5, which according to the literature contains main genes for freezing tolerance, microsatellite analysis was conducted with SSR loci specific for this group of chromosomes. Firstly, SSR loci with polymorphism between Aurora and Aurotica were selected, and then primers to these loci were used for analysis of F4 and F5 plants. PCR products were separated in denaturing polyacrylamide gel with urea. Some introgressive lines produced products with the same electrophoretic mobility as Aurora; other lines produced products the same as Aurotica, some introgressive lines produced amplification products differing both from Aurora and Aurotica. These "new" alleles could have appeared as a result of mutations in SSR loci. According to the results of the SSR analysis, it could be assumed that some wheat chromosomes of homeological group 5 were replaced by the chromosomes of T genome; other chromosomes had replaced arms or smaller translocations, which could form "mosaic" chromosomes with alleles at some SSR loci specific to Aurora, and at other SSR loci – alleles specific to Aurotica. It was shown that lines with alleles of SSR loci on 5A chromosome specific to Aurotica were characterized by better winter field survival. According to the results of free proline quantification and determination of electric conductivity (electrolyte leakage through the membranes damaged by the freezing stress), it was demonstrated that Aurotica accumulated less free proline during the period of cold acclimation and was characterized by the higher electric conductivity (greater electrolyte leakage), compared to Aurora. These results indicated that higher winter hardiness of Aurotica was provided by different molecular mechanisms than free proline accumulation and changes in membranes that prevent electrolyte leakage after freezing stress. In the experiments of laboratory freezing of Aurora and Aurotica seedlings (crowns) and the following survival assessment, Aurotica demonstrated better survival. During the preparation for the freezing experiments, when seedlings were excavated from the soil after cold acclimation, a useful observation was made that Aurotica formed more developed (stronger) root system compared to Aurora, when grown at low positive temperature (4°C, cold acclimation conditions). Based on this observation, on the following stage of the investigation root system characteristics were studied for Aurotica, Aurora and introgressive lines. For the root system study those introgressive lines were selected, that were previously studied for the presence of introgressions in their chromosomes of homeological group 5 (SSR analysis). Plants for the following root system investigation were grown in paper boxes in laboratory and also in the field. Such root system characteristics as maximum root length, root number and root volume (determined as volume of liquid supplanted by the roots) were determined. For the traits of root number and maximum root length no difference was found for Aurora and Aurotica. It was assumed that Aurotica forms more lateral roots or/and thicker roots compared to Aurora. Difference between Aurora and Aurotica was identified for root volume (determined as volume of supplanted liquid). Root system with higher volume was statistically significantly correlated with the presence of SSR alleles specific to Aurotica (T genome) instead of 5A specific alleles. This could be evidence that genes participating in the control of root development could be localized on 5A chromosome. Plants grown in the field were also assessed for the number of productive shoots and winter hardiness (number of plants that survived winter in the field). It was shown that Aurora has twice lesser ration root system volume (determined as volume of supplanted by roots liquid) to number of productive shoots. Introgressive lines with higher correlation of root volume to the number of productive shoots were characterized by better field survival compared to Aurora. According to these results, conclusion was made that plants’ winter tolerance is related to the ratio of root system volume to the number of productive shoots. In order to find candidate genes for increased winter hardiness of Aurotica, amplification products produced with Aurora’s and Aurotica’s DNA with primers to genes AGL21 and AGL14 (genes of MADS box transcription factors which influence auxin accumulation in roots), BRI (gene of brassinosteroid receptor), CBF-A14 (gene of a transcription factor of the CBF family: C-repeat Binding Factors; these are among the main transcriptional regulators of freezing tolerance) were analyzed. No polymorphism was identified for amplification products obtained with Aurora’s and Aurotica’s DNA with primers to genes ТаAGL14, BRI та CBF-A14, for this reason introgressive lines were not analyzed using these primers. AGL21 encodes a MADS box transcription factor, which positively regulates auxin accumulation in lateral root primordia by the regulation of auxin biosynthesis. Auxin is one of the main plant hormones regulating root development. Polymorphism between Aurora and Aurotica was shown for amplification products obtained with primers to the second part of the TaAGL21 gene. These primers were used to obtain PCR products with DNA of the introgressive lines, and analysis was conducted if these products are the same as Aurora’s or Aurotica’s. Comparing the results with winter survival assessment, it was demonstrated that lines with ТаAGL21 specific to Aurotica were characterized by better winter field survival. Plants for root system assessment were grown in cardboard boxes in 2015 in conditions of cold acclimation (gradual temperature decrease in autumn), and in 2016 without acclimation (in the room with controlled climate, 20°С) in order to determine if root system development depend on cold acclimation process and on specific allele of TaAGL21 gene. According to the obtained results, cold acclimation process contributes to the formation of more developed root system with longer roots in case of the presence of Aurotica specific TaAGL21 allele. On the other hand, without acclimation better developed root system forms in plants with Aurora allele of TaAGL21. For the root number there was no difference between plants grown in 2015 and 2016; therefore, it could be concluded that these trait did not depend on cold acclimation process. For the trait of root volume (determined as volume of supplanted liquid), Aurotica formed more developed root system in 2015 (with cold acclimation), whereas Aurora formed root system with greater volume in 2016 (no cold acclimation). Therefore, in cold acclimation conditions Aurotica forms better developed root system than Aurora, which could be related to the presence of specific allele of the TaAGL21 gene, and its higher winter hardiness.
The dissertation is devoted to the investigation of mechanisms of higher winter hardiness of the amphidiploid Aurotica, which combines in its genome AABB tetracomponent of common wheat cultivar Aurora and TT genome of the diploid wild wheat relative Aegilops mutica (Amblyopyrum muticum). Introgressive lines Triticum aestivum / Aegilops mutica were developed by crossing Aurotica x Aurora and the following self-pollination of the hybrids, which was possible due to the recombination between the chromosomes of D and T genomes. Chromosome numbers were determined in hybrid generations F3, F4 and F5, and only 40-43-chromosome F4 plants were chosen to form F5 generation in order to get 42-chromosome euploids introgressive lines. Changes in chromosome plates of the hybrid plants were observed: presence of telocentric chromosomes, dicentric chromosomes and number of satellite chromosomes differing from Aurora and Aurotica. These changes could be evidence of chromosome rearrangements in the genomes of hybrid plants possibly caused by introgression of alien genetic material. Presence of T genome genetic material in the genomes of the introgressive lines was confirmed by dot blot hybridization with genome DNA of Aegilops mutica as probe; most lines demonstrated positive hybridization signals. Additionally, morphological traits assessment also gave evidence on the presence of alien genetic material (from T genome) in the genomes of the lines: all lines differed from Aurora at least for some traits that have been assessed (traits of the spike – like glume color, glume hairiness and others; and vegetative part of the plant – hairiness, glaucousness). Most introgressive lines also were resistant to powdery mildew, which should be due to resistance genes from T genome, as we assumed. In order to indentify introgressions in chromosomes of homeological group 5, which according to the literature contains main genes for freezing tolerance, microsatellite analysis was conducted with SSR loci specific for this group of chromosomes. Firstly, SSR loci with polymorphism between Aurora and Aurotica were selected, and then primers to these loci were used for analysis of F4 and F5 plants. PCR products were separated in denaturing polyacrylamide gel with urea. Some introgressive lines produced products with the same electrophoretic mobility as Aurora; other lines produced products the same as Aurotica, some introgressive lines produced amplification products differing both from Aurora and Aurotica. These "new" alleles could have appeared as a result of mutations in SSR loci. According to the results of the SSR analysis, it could be assumed that some wheat chromosomes of homeological group 5 were replaced by the chromosomes of T genome; other chromosomes had replaced arms or smaller translocations, which could form "mosaic" chromosomes with alleles at some SSR loci specific to Aurora, and at other SSR loci – alleles specific to Aurotica. It was shown that lines with alleles of SSR loci on 5A chromosome specific to Aurotica were characterized by better winter field survival. According to the results of free proline quantification and determination of electric conductivity (electrolyte leakage through the membranes damaged by the freezing stress), it was demonstrated that Aurotica accumulated less free proline during the period of cold acclimation and was characterized by the higher electric conductivity (greater electrolyte leakage), compared to Aurora. These results indicated that higher winter hardiness of Aurotica was provided by different molecular mechanisms than free proline accumulation and changes in membranes that prevent electrolyte leakage after freezing stress. In the experiments of laboratory freezing of Aurora and Aurotica seedlings (crowns) and the following survival assessment, Aurotica demonstrated better survival. During the preparation for the freezing experiments, when seedlings were excavated from the soil after cold acclimation, a useful observation was made that Aurotica formed more developed (stronger) root system compared to Aurora, when grown at low positive temperature (4°C, cold acclimation conditions). Based on this observation, on the following stage of the investigation root system characteristics were studied for Aurotica, Aurora and introgressive lines. For the root system study those introgressive lines were selected, that were previously studied for the presence of introgressions in their chromosomes of homeological group 5 (SSR analysis). Plants for the following root system investigation were grown in paper boxes in laboratory and also in the field. Such root system characteristics as maximum root length, root number and root volume (determined as volume of liquid supplanted by the roots) were determined. For the traits of root number and maximum root length no difference was found for Aurora and Aurotica. It was assumed that Aurotica forms more lateral roots or/and thicker roots compared to Aurora. Difference between Aurora and Aurotica was identified for root volume (determined as volume of supplanted liquid). Root system with higher volume was statistically significantly correlated with the presence of SSR alleles specific to Aurotica (T genome) instead of 5A specific alleles. This could be evidence that genes participating in the control of root development could be localized on 5A chromosome. Plants grown in the field were also assessed for the number of productive shoots and winter hardiness (number of plants that survived winter in the field). It was shown that Aurora has twice lesser ration root system volume (determined as volume of supplanted by roots liquid) to number of productive shoots. Introgressive lines with higher correlation of root volume to the number of productive shoots were characterized by better field survival compared to Aurora. According to these results, conclusion was made that plants’ winter tolerance is related to the ratio of root system volume to the number of productive shoots. In order to find candidate genes for increased winter hardiness of Aurotica, amplification products produced with Aurora’s and Aurotica’s DNA with primers to genes AGL21 and AGL14 (genes of MADS box transcription factors which influence auxin accumulation in roots), BRI (gene of brassinosteroid receptor), CBF-A14 (gene of a transcription factor of the CBF family: C-repeat Binding Factors; these are among the main transcriptional regulators of freezing tolerance) were analyzed. No polymorphism was identified for amplification products obtained with Aurora’s and Aurotica’s DNA with primers to genes ТаAGL14, BRI та CBF-A14, for this reason introgressive lines were not analyzed using these primers. AGL21 encodes a MADS box transcription factor, which positively regulates auxin accumulation in lateral root primordia by the regulation of auxin biosynthesis. Auxin is one of the main plant hormones regulating root development. Polymorphism between Aurora and Aurotica was shown for amplification products obtained with primers to the second part of the TaAGL21 gene. These primers were used to obtain PCR products with DNA of the introgressive lines, and analysis was conducted if these products are the same as Aurora’s or Aurotica’s. Comparing the results with winter survival assessment, it was demonstrated that lines with ТаAGL21 specific to Aurotica were characterized by better winter field survival. Plants for root system assessment were grown in cardboard boxes in 2015 in conditions of cold acclimation (gradual temperature decrease in autumn), and in 2016 without acclimation (in the room with controlled climate, 20°С) in order to determine if root system development depend on cold acclimation process and on specific allele of TaAGL21 gene. According to the obtained results, cold acclimation process contributes to the formation of more developed root system with longer roots in case of the presence of Aurotica specific TaAGL21 allele. On the other hand, without acclimation better developed root system forms in plants with Aurora allele of TaAGL21. For the root number there was no difference between plants grown in 2015 and 2016; therefore, it could be concluded that these trait did not depend on cold acclimation process. For the trait of root volume (determined as volume of supplanted liquid), Aurotica formed more developed root system in 2015 (with cold acclimation), whereas Aurora formed root system with greater volume in 2016 (no cold acclimation). Therefore, in cold acclimation conditions Aurotica forms better developed root system than Aurora, which could be related to the presence of specific allele of the TaAGL21 gene, and its higher winter hardiness.
Description
Keywords
інтрогресивні лінії, Aegilops mutica (Amblyopyrum muticum), Triticum aestivum, зимостійкість, коренева система, мікросателітні локуси, транскрипційні фактори, ауксин, дисертація, introgressive lines, Aegilops mutica (Amblyopyrum muticum), Triticum aestivum, root system, winter hardiness, SSR, transcription factors, auxin, thesis