011. Дисертації

Permanent URI for this community

https://ekmair.ukma.edu.ua/handle/123456789/43

Browse

Browsing 011. Дисертації by Subject "Aegilops mutica (Amblyopyrum muticum)"

Now showing 1 - 1 of 1
  • Thumbnail Image
    Item
    Молекулярно-генетичні механізми стійкості до холодового стресу в геномно-заміщеної форми пшениці: дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
    (2017) Єфіменко, Тетяна; Антонюк, Максим
    В дисертаційному дослідженні показано зв’язок архітектури кореневої системи геномно-заміщеного амфідиплоїда Авротіка з його підвищеною стійкістю до низьких температур. Амфідиплоїд Авротіка містить у своєму геномі тетракомпонент (ААВВ) геному сорту пшениці Аврора (ААВВDD) і ТТ геном диплоїдного виду Aegilops mutica (Boissier). Було створено інтрогресивні лінії, що походять від схрещування Авротіка х Аврора та наступного самозапилення. Під час створення інтрогресивних ліній, перевіряли кількість хромосом в первинних корінцях паростків (аналіз метафазних пластинок) для поколінь F3, F4 та F5, та добирали рослини з такою кількістю хромосом, від яких потім можна було отримати 42-хромосомні інтрогресивні лінії. Наявність генетичного матеріалу Т геному Aegilops mutica в геномах інтрогресивних ліній було підтверджено методом дот-блот гібридизації з використанням геномної ДНК Ae. mutica як зонда; для більшості ліній було отримано позитивний сигнал. Оцінка рослин інтрогресивних ліній за деякими ознаками морфології колоса (остистість, форма та щільність колоса, колір зрілого колоса, опушення колосової луски, форма луски тощо) та вегетативної частини рослини (опушення зеленої рослини, воскова осуга), а також за ознакою стійкості до борошнистої роси також вказує на наявність чужинного генетичного матеріалу в їхніх геномах – більшість ліній відрізняються від сорту Аврора за декількома ознаками морфології та мають стійкість до борошнистої роси, яка, за нашими припущеннями, пов’язана з генами стійкості з Т геному. Для встановлення наявності інтрогресій у складі хромосом 5 гомеологічної групи, де за даними літератури локалізовані основні гени, що відповідають за морозостійкість пшениці, було використано мікросателітний аналіз за тими SSR локусами, які вважаються специфічними до хромосом цієї групи. Спочатку було встановлено, праймери до яких мікросателітних локусів утворюють поліморфні продукти для Аврори та Авротіки, і далі за цими SSR локусами було проаналізовано рослини поколінь F4 та F5 (з використанням більшої кількості мікросателітних локусів). Продукти ампліфікації розділяли у поліакриламідному гелі за денатуруючих умов. З ДНК деяких ліній утворювався продукт ампліфікації, що не відрізнявся за електрофоретичною рухливістю від такого, що утворювався з ДНК Аврори. З ДНК інших ліній утворювався продукт ампліфікації, що не відрізнявся від продукту Авротіки, а з ДНК третьої групи ліній утворювався продукт, що був відмінним від продуктів обох батьківських форм (як Аврори, так і Авротіки). Утворення таких продуктів ампліфікації, не властивих жодному з генотипів ініціального схрещування Авротіка х Аврора, може пояснюватися утворенням нових алелів через підвищений рівень мутацій в ділянках SSR локусів. За наявністю алелів мікросателітних локусів, характерних для Авротіки, можна було припустити заміщення цілих хромосом 5-ої групи Аврори на хромосому 5Т Авротіки, або плечей цих хромосом, або формування "мозаїчних" хромосом, в яких чергуються ділянки хроматину Аврори та Авротіки. Утворення таких хромосом можливе через часткову рекомбінацію хромосом Т і D геномів. Для порівняння зимостійкості Аврори та Авротіки спочатку використовували непрямі методи: визначення вмісту вільного проліна, визначення електричної провідності (витікання електролітів), проте, за нашими результатами, характеристики Аврори за цими методами були кращими, ніж Авротіки – Аврора накопичувала більшу кількість вільного проліна від час періоду холодового загартовування, ніж Авротіка, а також Аврора мала менші показники електричної провідності, ніж Авротіка (витікала менша кількість електролітів після заморожування, що може вказувати на менший ступінь пошкоджень мембрани). Було зроблено висновок, що в основі кращої зимостійкості Авротіки, порівняно з Авророю, лежать інші механізми, відмінні від накопичення вільного проліна та меншого витікання електролітів. Під час підготовки паростків Аврори та Авротіки до експерименту з лабораторного заморожування (в спеціальному рідинному термостаті з поступовим зниженням температури) було помічено, що при вирощуванні за низьких позитивних температур (4°С), Авротіка формує міцнішу, краще розвинену кореневу систему у порівнянні з такою Аврори. Це спостереження доло змогу припустити, що особливості кореневої системи Авротіки можуть мати зв’язок з її кращою зимостійкістю, і це було перевірено на наступному етапі дослідження. Щодо експерименту з лабораторного заморожування, то за його результатами Авротіка показала краще відростання, ніж Аврора. Для вивчення розвитку кореневої системи були обрані інтрогресивні лінії, вивчені за структурою геному щодо хромосом 5-ої гомеологічної групи, оскільки показано участь хромосом цієї гомеологічної групи у формуванні ознаки морозостійкість. Розвиток кореневої системи вивчали на рослинах, вирощених у пакетах з ґрунтовою сумішшю, та рослинах, вирощених у польових умовах. Вимірювали такі характеристики кореневої системи: кількість коренів, максимальна довжина кореня, об’єм кореневої системи (визначали за об’ємом рідини, яку витісняє коренева система при зануренні у посудину з рідиною). При порівнянні характеристик кореневої системи Аврори та Авротіки не було виявлено різниці за ознаками довжина найдовшого кореня та кількість коренів, але спостерігалася різниця за ознакою об'єм витісненої рідини. Було припущено, що Авротіка утворює більшу кількість бічних розгалужень коренів, або корені мають більшу товщину. За отриманими результатами, формування більш розвиненої кореневої системи, що оцінювалося за обсягом витісненої рідини, статистично значуще пов’язано з наявністю маркерів (алелів SSR-локусів) хромосоми 5Т замість маркерів хромосоми 5А. Це може вказувати на можливий зв’язок з хромосомою 5А пшениці генів, які беруть участь у формуванні кореневої системи пшениці. Рослини, що вирощували в полі, оцінювали також за кущистістю (кількість продуктивних стебел) та успішністю зимування (кількість рослин, які після зими перейшли до стадії колосіння). Було показано, що Аврора відрізняється від Авротіки за співвідношенням об’єм коренів (за витісненою рідиною)/кущистість у менший бік удвічі. Лінії, які характеризуються високим відношенням об'єм коренів/кущистість, всі, крім однієї, показали більш високий відсоток рослин, що вижили, порівняно з показником Аврори. Отримані результати дали змогу припустити, що стійкість рослин ліній до зимових стресових умов пов’язана з об'ємом кореневої системи відносно продуктивної кущистості та збільшується разом зі зменшенням відношення кількісті продуктивних стебел до об'єму кореневої системи. Для пошуку генів-кандидатів, що можуть впливати на формування кореневої системи, аналізували продукти ампліфікації, що утворюють ДНК Аврори та Авротіки з праймерами до таких генів: AGL21 та AGL14 (гени MADS box транскрипційних факторів, що впливають на накопичення ауксина в корені), BRI – ген рецептора брасиностероїдів (фітогормони, які задіяні у регуляції розвитку коренів). Було перевірено також CBF-A14 – ген транскрипційного фактора родини CBF (C-repeat Binding Factor) – один з основних транскрипційних регуляторів морозостійкості. Між ДНК Аврори та Авротіки не було виявлено поліморфізму за спектрами продуктів ампліфікації з праймерами до генів ТаAGL14, BRI та CBF-A14, тому інтрогресивні лінії не аналізувалися з цими праймерами. AGL21 кодує MADS box транскрипційний фактор, який позитивно регулює накопичення ауксину в примордіях бічних коренів через регуляцію біосинтезу ауксину, який стимулює ініціація і ріст бічних коренів. Показано наявність поліморфізму для продуктів ампліфікації, утворених з праймерами до другої частини гена TaAGL21. Ці праймери були використані для утворення продуктів ампліфікації з ДНК ліній – похідних Авротіки та аналізу продуктів ампліфікації щодо того, чи вони є схожі за масою на продукт Авротіки, чи на продукт Аврори. При порівнянні результатів з оцінкою зимостійкості показано, що лінії з алелем гена ТаAGL21, властивим Авротіці, за успішністю у перенесенні зимових стресів перевищують лінії, яким властивий алель Аврори за цим геном. Рослини для вимірювання характеристик кореневої системи вирощували в поліетиленових пакетах з ґрунтовою сумішшю в 2015 році за умов природного загартовування (поступове зниження температури восени), та в 2016 році в кімнаті контрольованого клімату за оптимальної температури (20°С) без холодового загартовування щоб встановити чи залежить розвиток кореневої системи від наявності/відсутності загартовування рослин і чи пов’язаний цей процес з алелем гена TaAGL21, властивим лініям. За отриманими результатами можна припустити, що природне загартовування сприяє формуванню більш розвиненої кореневої системи через збільшення довжини коренів за наявністю алеля "2" гена AGL21, в той час як без загартовування краще розвивається коренева система у рослин з алелем "1" гена AGL21. За кількістю коренів рослини, вирощені у 2016 році, не відрізнялись від таких, вирощених у 2015 році, можливо, що вираз цієї ознаки не залежить від загартовування. Для ознаки об’єм кореневої системи (визначений за об’ємом витісненої рідини) варіювання навколо групового середнього значення генотипних середніх в різні роки є однаковим для зразків з алелем "1" гена AGL21 та різним для зразків з алелем "2". В 2015 році (за умов загартовування) більш розвинену коренева система (більший об’єм витісненої рідини) мала Авротіка, а в 2016 році (без загартовування) Аврора утворювала більшу кореневу систему порівняно з Авротікою. Отже, за умов низьких температур, Авротіка формує краще розвинену кореневу систему, що може бути пов’язано з алелем "2" гена ALG1, що, в свою чергу, має позитивний зв’язок із зимостійкістю.